Metodologia

Esta revisão integrativa da literatura foi realizada de acordo com as recomendações do Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA), sendo incluídos estudos envolvendo mecanismos de edição gênica por CRISPR/Cas9. A busca foi realizada nas bases de dados Scielo, PubMed e LILACs com os seguintes descritores, de acordo com os Descritores em Ciências da Saúde (DeCS) ou o Medical Subject Headings (MeSH): ((Huntington) OR (Proteína Huntingtina)) AND (edição gênica) e ((Huntington) OR (Huntingtin protein)) AND (Gene editing). Foram considerados artigos de acesso aberto, publicados em português, inglês ou espanhol. Não foram estabelecidos limites para o ano de publicação dos artigos com as palavras-chave. A busca resultou em 63 artigos, sendo selecionados 26 para realização da revisão de literatura. Adicionalmente, para análise de interações gênicas foi utilizada a ferramenta on line GeneMania (disponível em: https://genemania.org/) para análise dos mecanismos relacionados ao IT-15, HAP1 e HIP14/ZDHHC179. Para tal, foi inicialmente inserido o gene de interesse, IT-15 e os genes de maior interação foram selecionados para complementação da revisão de literatura. Frente ao exposto, este trabalho foi dividido em três eixos temáticos: Doença de Huntington, manifestações clínicas e o tratamento convencional e edição pelo sistema CRISPR-Cas9.

Doença de Huntington

A doença de Huntington (DH) é transmitida de forma autossômica dominante, o que significa que pelo menos um progenitor do indivíduo acometido é portador da doença, sendo que cada filho de um portador possui 50% de chance de herdar a mutação e desenvolvê-la5.

Sua fisiopatologia é descrita como um distúrbio neuropsiquiátrico gradual, levando às modificações cognitivas, motoras, perceptivas e comportamentais5. Na neuropatologia é descrita a disfunção e morte dos neurônios. Os pacientes, além dos sintomas relacionados ao sistema nervoso central, também podem apresentar distúrbios imunológicos e metabólicos, perda de peso e osteoporose10.

O gene IT-15 está localizado no braço curto do cromossomo 4, próximo a região telomérica, possui 67 éxons e codifica a proteína Huntingtina (HTT) Figure 1. A mutação nesse gene leva à expansão instável de repetições do trinucleotídeo CAG na extremidade 5’, que corresponde ao aminoácido glutamina1.

A sequência CAG codifica o aminoácido glutamina e a sua expansão leva à formação de cadeias poliglutamínicas (PoliQ)11. As repetições CAG possuem uma variação dentro da normalidade, sendo esse número entre 9 e 34, enquanto na DH esse número é maior que 40 repetições da sequência de trinucleotídeos. O número que repetições está relacionado com a precocidade da manifestação da doença sendo que, quanto maior o número, mais precoce será a manifestação clínica2. Indivíduos assintomáticos apresentam número menor que 35 repetições CAG, entre 35 e 39 repetições são observadas nas formas tardias da doença e quando observadas de 40 a 50 está relacionada a forma adulta da DH. Manifestações precoces e juvenil dos sintomas surgem quando ocorrem repetições mais longas, acima de 50 trinucleotídeos3.

Durante a meiose, o alelo mutado é muito instável, alterando o seu comprimento na maioria das transmissões entre gerações, aumentando de 1-4 unidades ou com decréscimo de 1-2 unidades no trinucleotídeo CAG. Expansões maiores são raras e estão ligadas à transmissão paterna, levando a uma maior taxa de mutação no decorrer da espermatogênese, sendo classificada como uma doença monogênica12, 13.

A proteína Huntingtina mutada (HTTm), como consequência da série de repetições, apresenta resíduos de glutamina alinhados no terminal amínico3. A proteína apresenta maior resistência à degradação e fragmentação proteica que leva a aumento nas cadeias poliglutamínicas, estes que formam agregados citoplasmáticos que se depositam gerando resíduos tóxicos que acarretam na degeneração do axônio2. Além desse mecanismo, a neurodegeneração pode ser causada por anomalias na interação proteína-proteína, expressão gênica alterada, sistemas celulares lisossomais e ubiquitina-proteossômico desregulados, acumulação de espécies reativas de oxigênio (ERO) e apoptose causadas pela disfunção mitocondrial14.

Manifestações clínicas e o tratamento convencional

As manifestações clínicas da DH são caracterizadas pelo distúrbio gradual que leva às alterações motoras e emocionais, acarretando um prejuízo cognitivo ao paciente. A atrofia dos gânglios da base causada pelas lesões em vários tecidos, oriundas da alteração do transporte celular, alteração da transcrição, formação de corpos de inclusão intracelulares e apoptose da HTTm, conduz às manifestações clinicas2.

A sintomatologia da DH apresenta-se, inicialmente, por falta de interesse pelas atividades cotidianas e irritabilidade, que com o passar do tempo evoluem para a falta de equilíbrio e hiperatividade. A demência é manifestada através das alterações de personalidade, emocionais e perda de memória1.

O sinal clinico mais comum e que remete à sua denominação é a “coréia”, sintomas que ocorrem devido a alteração do sistema nervoso central (SNC) e são descritos como movimentos involuntários e em forma de ondas, no sentido distal para proximal, afetando a marcha, o movimento de extensão e flexão dos dedos, cruzar e descruzar as pernas e alguns sintomas faciais, como contração muscular e elevação da sobrancelha^. O paciente também pode apresentar declínio da cognição que leva a dificuldade de planejar e executar tarefas. Também é comum a presença de sintomas psiquiátricos como a depressão, ansiedade, apatia, que muitas vezes resultam em tentativa de suicídio5.

O tratamento convencional baseia-se no uso de fármacos da classe dos neuropléticos que bloqueiam os receptores de dopamina ou provocam depleção nos terminais monoaminérgicos, atuando sobre o sintoma de coréia e sobre os distúrbios comportamentais, entretanto o uso dessa classe de fármacos pode trazer reações adversas15. O fármaco mais utilizado foi aprovado em 2008 para uso nos Estados Unidos, a tetrabenazina (TBZ) é um depletor seletivo de dopamina por via da inibição do transporte de monoaminas16. Em relação aos sintomas de apatia e depressão, estes podem ser tratados com inibidores de recaptação da serotonina e antidepressivos17. Até hoje nenhuma droga mostrou-se capaz de interromper ou retardar a evolução da patologia, entretanto muitos dos sintomas podem ser melhorados15.

Outro tipo de tratamento utilizado é o não farmacológico, que envolve uma equipe multiprofissional, composta por enfermeiros, fonoaudiólogos, fisioterapeutas, conselheiros genéticos e terapeutas ocupacionais, que irão auxiliar na melhora da qualidade de vida do paciente portador de DH2.

Edição pelo sistema CRISPR-CAS9

   O reconhecimento de que a proteína HTT mutante desencadeia a doença tem levado à busca do silenciamento gênico como um potencial caminho terapêutico18. Estudos demonstram que a HTTm interage de maneira não habitual com várias proteínas formando agregados proteicos que podem ocasionar a desregulação de vias de sinalizações intracelulares importantesFigure 2 2.

A formação dos agregados proteicos está relacionada com a interação frágil entre a HTTm e a HIP14 (huntingtin-interacting protein 14) (ZDHHC17) o que leva à diminuição da palmitoilação da cisteína 214. A agregação também acontece devido a interação da HTTm com a palmitoil-transferase da HIP1419.

O HTT, ao interagir com HAP1 indiretamente, e com a dineína diretamente, controla o tráfego de organelas tanto no sentido retrógrado e anterógrado, quanto nos axônios e dendritos dos neurônios10. A interação entre HTTm e HAP1 (huntingtin-interacting protein 1, huntingtin-associated protein) acarreta em uma perturbação no transporte axonal de um fator neurotrófico que é essencial para o sustento dos neurônios estriatais, o brain derived neurotrofic fator (BDNF)20. A proteína HAP1 está localizada em grande escala no cérebro e com grande seleção para os núcleos da base, podendo sugerir uma responsabilidade pela patogenia da DH com comprometimento cerebral21.

O CRISPR é um sistema que possui como mecanismo a projeção do RNA guia para reconhecimento da sequência do DNA que será o alvo das modificações. Inicialmente, as bases nitrogenadas precisam ser pareadas para simultaneamente também ocorrer o pareamento da região PAM (protoespaçador) do RNA guia com a sequência-alvo, e assim, algumas modificações são inseridas22.

Para fins terapêuticos a enzima nuclease Cas9 é combinada com um RNA guia, como crDNA e tracDNA, clivando a dupla fita do DNA em regiões mal pareadas. Posteriormente à clivagem, a reparação pode ocorrer através da junção de extremidades não homólogas ou junção de extremidades homólogas, sendo a segunda uma técnica mais promissora por estar voltada para o nocaute, acatando as novas modificações inseridas pelo RNA guia4, 22. As modificações levam à novas mutações, acarretando em falhas na sequência, gerando proteínas não funcionais através do bloqueio da transcrição do gene em mRNA, o chamando knockout gênico7, 22. Com o CRISPR é possível corrigir a expressão de alguns genes mutantes e atenuar neuropatologias associadas ao DNA mutado23.

Para que o processo descrito acima ocorra é necessário direcionar o sistema CRISPR-Cas9 para os neurônios dopaminérgicos, utilizando como transporte até as células alvos o plasmídeo23. A excisão precisa acontecer na região promotora, responsável por iniciar a transcrição e expansão CAG, produzindo uma completa inativação da HTTm4.

Através do método ex vivo, são extraídas as células do paciente e a modificação ocorre em cultura de células por meio da transfecção destas células com o plasmídeo codificando o Cas9 e a sequência de interesse (CAG). Finalizado o processo, as células são transplantadas novamente ao paciente24, 25.

Estudos em camundongos de modelo Q140 demonstraram que a utilização do CRISPR-Cas9 voltado para o silenciamento, reduziu a proteína HTTm, e atenuou o fenótipo comportamental da patologia, contudo, não foi alcançada sobrevida do modelo em questão4.

As modificações no gene IT-15 poderiam não apenas gerar impactos na sua função e localização do HTTm, mas também na de outras proteínas, como é no caso do HTT interagindo com HIP14 e HIP14L (da família das palmitoil-acil transferases – PATs) e regulam o tráfico intracelular e localização sináptica de várias proteínas nos neurônios. O HTT é, ele próprio, palmitoilado em cisteína 214, e a perda de HTT e a expansão de poliglutaminas leva à uma redução na atividade enzimática do HIP14 e de sua auto-palmitoilação, afetando na atividade do HIP14 em outros substratos7.

A palmitoilação (tioesterificação do ácido palmítico em resíduos de cisteína) pela HIP14 é de extrema importância para a plasticidade sináptica no sistema nervoso central em desenvolvimento e no adulto. Defeitos nesse processo, como o silenciamento, podem levar às mudanças na excitação e influência na vida neuronal26.

Estudos demonstram que a hiper expressão da HTTm leva à uma eficácia no transporte das organelas, enquanto o silenciamento diminui a motilidade. A HTT em associação com a HAP1 e dineína também ajuda no transporte de proteínas para o material pericentriolar, necessária para a ciliogênese, sendo que na sua ausência o cílio primário não é formado10.

A utilização do sistema CRISPR-Cas9 aumenta a possibilidade da edição gênica na linhagem germinativa, diminuindo o aparecimento da DH nas famílias tratadas. Entretanto, questões éticas acompanham essa aplicação, ademais, as expansões espontâneas poderão fazer com que a DH reapareça nas famílias, sendo estas levantadas como algumas vantagens e desvantagens da edição gênica na DH Table 1 4.